1. Tujuan :

Memberikan petunjuk bagi analis dalam melakukan Pengujian Vibrio cholerae.

2. Ruang Lingkup :

Prosedur ini digunakan untuk melakukan Pengujian Vibrio cholerae pada produk perikanan dan produk makanan yang berkaitan dengan hasil – hasil perikanan.

3. Acuan :

Standar Nasional Indonesia (SNI) 01-2332.4-2006

4. Media dan Reagensia :

  1. Alkaline Peptone water (APW)
  2. Alkaline Peptone salt (APS)
  3. Decarboxylase basal medium dengan penambahan suplemen arginine, lysine dan ornithine secara individual
  4. Kliger Iron Agar ( KIA)
  5. Motility Test Medium (MTM), semisolid
  6. MRV-VP Broth
  7. Purple Broth Base (PBB) dengan penambahan suplemen sucrose, lactose, cellobiose, arabinose, D-mannitol, D-mannose secara individual
  8. Of medium semisolid dengan penambahan suplemen glucose, sucrose, lactose, cellobiose, arabinose, D-mannitol, D-mannose secara individual
  9. Triple Sugar Iron (TSI) agar
  10. Thiosulfate-citrat-Bile-Salt-Sucrose (TCBS) agar
  11. Trypticase (tryptic) Soy Broth (TSB)
  12. Trypticase (tryptic) Soy Agar (TSA)
  13. Tryptone Broth and Tryptone salt Broths (T1N0, T1N1, T1N3,T1N6,T1N8,T1N10)
  14. Urea Broth
  15. Pereaksi Kovacs
  16. Mineral atau parafin oil steril
  17. O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine) disk, 10 µg dan 150 µg
  18. ONPG disk
  19. Pereaksi oksidase
  20. HCL 1 N
  21. Physiological saline 0,85%
  22. Phospate-buffered Saline (PBS)
  23. NaCl 2 % dan 3 %
  24. Larutan NaOH 1 N
  25. Pereaksi VP
  26. Pereaksi pewarnaan gram
  27. Baku pembanding Vibrio cholerae
  28. Anti serum Poly hikojima inaba – ogawa

5. Peralatan

  1. Blender beserta jar yang dapat disterilisasi atau stomacher beserta plastik steril.
  2. Cawan petri ukuran 15 mm x 100 mm
  3. Tabung reaksi ukuran 16 mm x 125 mm dan 13 mm x 100 mm
  4. Tabung bertutup ukuran 16 mm x 150 mm
  5. Timbangan analitik dengan ketelitian 0,01 g dan 0,0001 g
  6. Inkubator 36 °C ± 1 °C
  7. Waterbath 42 °C ± 0,2 °C
  8. Autoclave 121 °C.
  9. Jarum inokulasi dan jarum ose
  10. Bunsen
  11. pH meter
  12. Peralatan sterilisasi filter
  13. Oven
  14. Pipet atau pippetor 1 ml, 5 ml dan 10 ml.
  15. Mikroskop
  16. Hot plate dilengkapi dengan magnetic stirer.
  17. Alat pengocok (Voltex mixer )

6. Kondisi Pengujian

Selama melakukan pengujian, terapkan teknis aseptis dan lakukan pengujian diruang atau laminar air flow yang terkontrol. Media TCBS agar yang digunakan harus dalam keadaan kering.

Catatan : Khusus untuk monitoring kekerangan contoh kerang diuji dalam keadaan hidup jangan dibekukan.

7. Pengambilan contoh.

Komposisi dan berat contoh yang akan diuji diambil dengan ketentuan sebagai berikut :

7.1. Komposisi contoh

7.1.1. Ikan

Jaringan daging, saluran pencernaan dan insang.

7.1.2. Crustacea

Jika memungkinkan seluruh tubuh atau hanya bagian tengah termasuk insang dan saluran pencernaan.

7.1.3. Kekerangan

Daging kerang termasuk cairan dalam cangkang.

7.2. Berat contoh

7.2.1. Produk Kekerangan

Dengan menerapkan teknik aseptis, ambil secara komposit daging kerang termasuk cairan dalam cangkang dari 10 kerang hingga 12 kerang ( disesuaikan dengan berat contoh ), lalu homogenkan.

7.2.2. Produk Perikanan selain kekerangan

7.2.2.1 Kurang dari 1 kg

Dengan menerapkan teknik aseptis ambil contoh secara acak dan potong kecil – kecil hingga beratnya mencapai 100 g.

7.2.2.2. Antara 1 kg sampai 4,5 kg.

Dengan menerapkan teknik aseptis ambil contoh secara acak dan potong kecil – kecil hingga beratnya mencapai 300 g.

7.2.2.3. Lebih besar dari 4,5 kg

Dengan menerapkan teknik aseptis ambil contoh secara acak dan potong kecil – kecil hingga beratnya mencapai 500 g.

Catatan : contoh beku dilelehkan pada saat akan dianalisa. Pelelehan dilakukan selama 18 jam pada suhu sekitar 2oC – 5oC atau pada suhu 45oC tidak lebih darai 15 menit.

8. Prosedur

8.1. Persiapan contoh

8.1.1. Produk perikanan selain kekerangan.

Timbang secara aseptis 25 g sesuai butir 7.2.2.1 dan 7.2.2.2., kemudian tambahkan 225 ml larutan Alkaline Pepton Water, Homogenasi selama 2 menit – 3 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 1 : 10.

8.1.2.  Produk kekerangan

Timbang secara aseptis 50 g sesuai butir 7.2.2.3., kemudian tambahkan 450 ml larutan Alkaline Pepton Water, Homogenasi selama 2 menit – 3 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 1 : 10.

8.2. Pengkayaan

8.2.1. Contoh produk perikanan selain kerang.

Siapkan 1 set pengenceran dengan cara melarutkan 1 ml homogenat (butir 8.1.1) kedalam    9 ml APW. Lakukan pengenceran sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. Inkubasi pada suhu 36 oC ± 1 oC selama  6 jam – 8 jam. Goreskan larutan pengkayaan (APW) ke TCBS agar (lihat butir 8.3.1). Inkubasikan kembali APW yang telah digoreskan tersebut selama 16 jam – 24 jam, lalu goreskan kembali ke TCBS agar.

8.2.2. Contoh kekerangan

Siapkan 2 set pengenceran dengan membagi Homogenat (butir 8.1.2) menjadi 2 bagian yang masing – masing mempunyai volume 250 ml. Inkubasikan 1 set pengenceran pada suhu 36 oC ± 1 oC dan 1 set pengenceran lainnya pada suhu 42 oC selama 6 jam – 8 jam. Goreskan larutan pengkayaan ke TCBS agar (lihat butir 8.3.1.) dan lanjutkan inkubasi selama 16 jam – 24 jam dan goreskan kembali larutan pengkayaan (APW) ke TCBS agar.

8.3. Isolasi Vibrio cholerae

8.3.1. Tanpa mengocok tabung (8.2.1 dan 8.2.2)

Ambil 1 ose dari setiap tabung yang positif (keruh) pada setiap pengenceran sedalam 1 cm dari permukaan cairan dan goreskan kedalam TCBS agar. Inkubasikan TCBS agar pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam.

8.3.2. Amati keberadaan Vibrio cholerae pada TCBS agar.

Koloni Vibrio cholerae besar, permukaan halus. Agak datar, bagian tengah uram dan bagian pinggir terang, berwarna kuning (sukrosa positif).

8.4. Pemurnian

Secara hati – hati ambil 3 koloni terduga atau lebih dari setiap TCBS agar, goreskan kedalam T1N1 agar atau TSA + 1,5 % NaCl (Total Mengandung NaCl 2 %). Inkubasikan selama 18 jam – 24 jam pada suhu 36 oC ± 1 oC.

8.5. Uji biokimia pendahuluan

8.5.1. Uji Oksidase

Goreskan 1 ose dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % atau medium lain yang tidak memfermentasikan karbohidrat kedalam cawan petri yang berisi TSA agar. Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam. Teteskan 2 – 3 tetes pereaksi oksidase pada koloni bakteri dan amati reaksinya. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tua pada koloni. Uji oksidase dapat dilakukan dengan menggunakan kertas oksidase dengan cara menggoreskan koloni dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % keatas permukaan  kertas oksidase menggunakan tusuk gigi (jangan menggunakan ose yang terbuat dari nikel atau krom). Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tua secara cepat.

8.5.2. Uji sensitifitas terhadap 0/129 vibriostat

Goreskan 1 ose dengan cepat dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % kedalam cawan Petri yang berisi TSA dengan rapat. Letakkan disk 0/129 10 µg dan 150 µg pada goresan yang paling rapat dan inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam. Amati pertumbuhan disekitar disk . Reaksi sensitif ditunjukkan dengan terbentuknya zona disekitar disk (S), sedangkan reaksi resisten ditandai dengan adanya pertumbuhan disekeliling disk (R). Vibrio cholerae sensitive terhadap       0/129 µg dan 150 µg.

8.5.3. Triple Sugar Iron (TSI) Agar dan Kligger Iron Agar (KIA)

Inokulasikan koloni dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % dengan cara menggoreskan agar miring dan menusuk agar tegak media TSI agar dan KIA. Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam. Vibrio cholerae menghasilkan asam (warna kuning) pada agar miring, asam (warna kuning) pada agar tegak dan tidak mengasilkan gas serta H2S. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media agar miring yang berbeda dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media agar yang berbeda

Bakteri KIA TSI
Agar Miring Agar Tegak Agar Miring Agar Tegak
v. cholerae K A A (K jarang) A
v. mimicus K A K (A jarang) A
v. parahaemolyticus K A K A
v. alginolytus K A A A
v. vulnificus K atau A A K (A jarang) A
a.hidrophilla K atau A A K atau A A
p.shigoleides K atau A A K atau A A

8.5.4. Uji ONPG

Untuk uji ONPG gunakan kultur dari TSI atau media lain yang mengandung lactose. Inokulasikan 1 ose kultur dari TSI kedalam tabung yang berisi 0,5 ml larutan psysiological saline. Masukkan disk ONPG lalu inkubasikan pada suhu  36 oC ± 1 oC selama 20 menit  sampai dengan 1 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning pada media dalam tabung.

8.5.5. Uji Oksidatif – fermentatif ( OF )

Inokulasikan 2 tabung kedalam media OF yang telah ditambahkan glukosa 1 % dengan kultur dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % tambahkan mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm kedalam salah satu tabung. Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 1 hari – 2 hari. Reaksi oksidatif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kunimg (reaksi asam) pada tabung yang tidak ditambahkan dengan mineral oil, sedangkan reaksi fermentative ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning pada tabung yang ditambahkan mineral oil. Asam mengubah media dari warna hijau menjadi kuning.

8.5.6. Pewarnaan gram

Lanjutan pengujian apabila pada uji biokimia pendahuluan diatas ditemukan reaksi Vibrio cholerae . Kultur diambil  agar miring atau TSA miring + NaCl 1,5 % yang telah diinkubasi selama 24 jam. Bakteri Vibrio cholerae termasuk gram – negatif, berbentuk batang pendek atau koma.

8.6. Uji Biokimia Lanjutan .

Lanjutkan pengujian apabila pada uji biokimia pendahuluan diatas ditemukan reaksi  Vibrio cholerae yang khas ( tabel 1). Goreskan kembali kultur dari T1N1 agar atau TSA + NaCl 1,5 % ke TSA dan TSB. Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam.

8.6.1. Uji Hidrolisis Urea.

Inokulasikan 1 ose dari TSA + NaCl 1,5 % kedalam media urea. Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan perubahan warna media dari orange menjadi merah muda. Vibrio cholerae tidak mempunyai kemampuan dalam menghidrolisis urea (reaksi negatif)

8.6.2. Uji Arginin dihydrolase, Lysin dekarboksilase dan ornithin dekarboksilase.

Inokulasikan kultur dari TSA + NaCl 1,5 % kedalam tabung media dasar dekarboksilase yang masing – masing mengandung arginin, Lysine, ornithin serta kedalam 1 tabung kontrol media dasar dekarboksilase yang tidak mengandung asam amino. Tambahkan masing – masing tabung dengan mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm. Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 4 hari. Lakukan pengamatan setiap hari. Reaksi dekarboksilase terhadap asam amino menghasilkan pH alkaline dan mengubah media menjadi ungu cerah (reaksi positif). Sedangkan reaksi fermentasi glucose menghasilkan asam dan mengubah media menjadi warna kuning (reaksi negatif). Tabung control yang tidak mengandung asam amino berubah menjadi kuning Vibrio cholerae menghasilkan reaksi arginin dihydrolase negative, Lysine dan ornithin positif dan orithin decarboxylase positif

8.6.3. Uji Toleransi terhadap garam

Inokulasikan kultur dari TSB kedalam 3 tabung yang masing – masing mengandung tryptone broth 1 % yang ditambahkan NaCl 0 % ; 1 % dan 3 % (T1N0,T1N3). Inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 18 jam – 24 jam. Reaksi positif ditandai dengan terjadinya keruhan yang menunjukkan pertumbuhan. Vibrio cholerae dalam media T1N0 dan T1N3 (table 2).

8.6.4. Uji pertumbuhan pada suhu 42 oC

Inokulasikan 1 ose dari TSB yang telah diinkubasikan selama 24 jam kedalam TSB yang telah dihangatkan dalam waterbath 42 oC. Inkubasikan pada suhu 42 oC dalam waterbath selama 24 jam. Reaksi positif ditandai dengan terjadinya kekeruhan yang menunjukkan adanya pertumbuhan. Vibrio cholerae mengasilkan reaksi variable.

8.6.5. Uji voges-proskauer

Inokulasikan 1 ose dari TSA+ NaCl 1,5 % kedalam MRV – VP broth inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 2 hari. Pindahkan 1 ml dari setiap MRV – VP broth yang menunjukkan pertumbuhan kedalam tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril. Tambahkan 0,6 ml larutan alphanaphtol dan 0,2 ml KOH 40 % lalu kocok. Tambahkan sedikit kristal keratin untuk mempercepat reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna merah muda sampai warna merah mirah delima (ruby) pada media Vibrio cholerae menghasilkan reaksi variable.

8.6.6. Uji Fermentasi karbohidarat

Inokulasikan 1 ose dari TSA+ NaCl 1,5 % kedalam masing – masing satu tabung purple broth base yang mengandung sucrose, lactose, D-mannitol, mannose, arabinosa atau cellobiose. Tambahkan masing – masing tabung dengan mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm. inkubasikan pada suhu 36 oC ± 1 oC selama 4 hari – 5 hari  dan lakukan pengamatan setia hari. Reaksi positif fermentasi karbohidrat menghasilkan asam dan mengubah media menjadi kuning ( table 2).

8.7. Uji Serologi

Ambil 1 ose kultur dari T1N1 agar atau TSA+ NaCl 1,5 % yang telah diinkubasikan selama 16 jam – 24 jam dan letakkan diatas gelas preparat. Tetesi dengan larutan saline 0,85 % dan emulsikan. Letakkan 1 tetes antiserum poly hikojima inaba – ogawa disamping suspensi koloni.

Campurkan antiserum sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai tercampur sempurna. Lakukan kontrol dengan menggunakan larutan saline dan antiserum.

Goyangkan  campuran tersebut  kekiri dan kekanan dan amati reaksi penggumpalan pada latar belakang yang gelap sebagai berikut :

Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada larutan control.

Negatif apabila tidak terjadi penggumpulan baik pada larutan kultur maupun larutan control.

9. Interpretasi Hasil

No Jenis Uji Interpretasi Hasil
1 Morfologi Gram – negatif, bentuk batang atau koma
2 TSI Agar miring: asam (kuning) Agar tegak: asam (kuning)
3 Oksidatif / fermentatif (media OF) Oksidatif positif dan fermentatif positif
4 Oksidase Positif
5 Arginin Dehidrolase Negatif
6 Lysine Decarboxylase Positif
7 VP Variabel
8 Pertumbuhan pada suhu 42oC Positif
9 Halophilik T1N0; positif; T1N3; positif , T1N6; negatif
10 Fermentasi Sucrose Positif
11 Fermentasi Arabinose Negatif
12 ONPG Positif
13 Sensitifitas terhadap 0/129 Sensitif (S) terhadap 10 µg dan 150 µg

10. Pelaporan Hasil

Laporkan ada atau tidak Vibrio cholerae berdasarkan uji biokimia dan serologi.