1. Tujuan :
Memberikan petunjuk bagi analis dalam melakukan pengujian Salmonella.

2. Ruang Lingkup :
Prosedur ini digunakan untuk melakukan pengujian Salmonella pada produk perikanan dan produk makanan yang berkaitan dengan hasil – hasil perikanan.

3. Acuan :
Standar Nasional Indonesia (SNI) 01-2332.2-2006

4. Media dan Reagensia
1. Bismuth sulfite Agar (BSA)
2. Brain Heath Infusion Broth
3. Hectoen Entrric (HE) Agar
4. Lactose Broth
5. Lysine Decarboxylase Broth
6. Lysine Iron Agar (LIA)
7. Malonate Broth
8. Motility Test Medium
9. MR-VP Broth
10. Phenol red Carbohydrate Broth
11. Potasium Cyanide (KCN) Broth
12. Purple Carbohydrate Broth
13. Rappaport – Vassiliadis (RV) medium
14. Selenite Cystine Broth (SCB)
15. Simmon Citrate Agar
16. Tetrathionate Broth (TTB)
17. Triple Sugar Iron (TSI) Agar
18. Trypticase Soy – Tryptose Broth
19. Tryptone (Tryptophane) Broth
20. Urea Broth
21. Urea Broth (Rapid)
22. Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar
23. Aquadest
24. Ethanol 70 %
25. Larutan Brillian Green Dye
26. Larutan Formalized Physiological Saline
27. Reagen Kovac’s
28. Indikator Methyl Red
29. Larutan Physiological Saline 0,85 %
30. Larutan potasium hydroxide 40 %
31. Reagen VP
32. Larutan 1 N sodium Hydroxide
33. Larutan 1 N Hydrochloric Acid
34. Salmonella Polyvalent somatic O Antiserum
35. Salmonella Polyvalent flagellar H Antiserum

5. Peralatan
1. Blender beserta jar yang dapat disterilisasi atau stomacher beserta plastik steril.
2. Pipet
3. Petridish ukuran 15 mm x 100 mm
4. Tabung reaksi ukuran 16 mm x 150 mm dan 20 mm x 150 mm
5. Rak tabung reaksi
6. Timbangan dengan ketelitian 0,0001 gr.
7. Inkubator 35 °C ± 1 °C
8. Inkubator 37 °C ± 0,5 °C
9. Waterbath 43 °C ± 0,2 °C
10. Waterbath 42 °C ± 0,2 °C
11. Waterbath 48 °C – 50 °C
12. Jarum inokulasi
13. Autoclave.
14. Alat pengocok (vortex mixer)
15. Bunsen
16. pH meter
17. Spatula
18. Filter apparatus
19. Oven
20. Hot plate dan stirrer

6. Preparasi contoh

Dengan menerapkan teknik aseptis, contoh diambil secara acak dan dipotong kecil – kecil hingga berat masing – masing contoh yang akan diuji sesuai ketentuan pada tabel 1.
Contoh beku dilelehkan pada saat akan dianalisa dan pelelehan dilakukan selama 18 jam pada suhu sekitar 2 °C – 5 °C atau suhu dibawah 45°C dan tidak lebih dari 15 menit.

Tabel 1. Berat contoh yang diambil yang akan diuji

Berat contoh Berat contoh yang akan diuji
kurang dari 1 kg atau 1 l 100 gr atau 100 ml
1 kg atau 1 l sampai dengan 4,5 kg atau 4,5 l 300 gr atau 300 ml
lebih dari 4,5 kg atau 4,5l 500 gr atau 500 ml

7. Prosedur
7.1. Pra pengkayaan.
a) Metode ini didasarkan pada analisa 25 g atau 25 ml contoh dengan perbandingan 1 : 9 untuk contoh dan media pengkayaan. Jika pengujian dilakukan secara komposit, tambahkan media pengkayaan yang cukup untuk menjaga perbandingan 1 : 9.
b) Untuk contoh dengan berat lebih kecil atau sama dengan 1 kg atau 1 l sampai dengan 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 25 g atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang akan diuji, kemudian masukkan dalam wadah atau plastic steril dan tambahkan 225 ml larutan lactose broth
c) Untuk contoh dengan berat lebih besar dari 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 50 g atau contoh cair sebanyak 50 ml, kemudian masukkan dalam wadah atau plastic steril dan tambahkan 450 ml larutan lactose broth.
d) Homogenkan selama 2 menit untuk dianalisa. Secara aseptis, pindahkan larutan contoh dalam wadah steril yang sesuai dan biarkan pada suhu ruang selama 60 menit dengan wadah tertutup. Kocok perlahan dan bila perlu tentukan pH sampai (6,8 ± 0,2). Kocok rata dan kendurkan tutup wadah secukupnya. Inkubasi 24 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C. Lanjutkan pengujian sesuai dengan prosedur.
7.2. Pengkayaan
a) Kencangkan tutup wadah dan kocok perlahan contoh yang diinkubasi.
Untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, pindahkan 0,1 ml larutan contoh ke dalam 10 ml Rappaport-vassiliadis (RV) medium dan 1 ml larutan contoh ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB); untuk jenis produk perikanan lain, pindahkan 1 ml larutan contoh ke dalam masing – masing 10 ml SCB dan 10 ml TTB.
b) Inkubasi media pengkayaan selektif sebagai berikut :
Untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, inkubasi RV medium selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 420C ± 0,20C (water bath), inkubasi TTB selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 430C ± 0,20C (water bath), untuk jenis perikanan lain, inkubasi TTB dan SCB selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C
7.3. Isolasi Salmonella
7.3.1. Kocok tabung (dengan vortex) dan dengan menggunakan jarum loop (3mm) gores TTB yang diinkubasi kedalam media HE, XLD dan BSA. Siapkan BSA sehari sebelum digunakan dan simpan di tempat gelap pada suhu ruang.
7.3.2. Gores kedalam media yang sama dari RV Broth atau SCB.
7.3.3. Inkubasi cawan BSA, HE dan XLD 24 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C.
7.3.4. Amati kemungkinan adanya koloni salmonella.
7.3.4.1 Pengamatan morphologi koloni salmonella yang khas (typical)
Ambil 2 atau lebih koloni salmonella dari masing – masing media Agar selektif setelah 24 jam ± 2 jam inkubasi. Koloni – koloni Salmonella yng khas (typical) adalah sebagai berikut :
a. HE agar.
Koloni hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
b. XLD Agar.
Koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
c. BSA
Koloni coklat, abu – abu atau hitam kadang – kadang metalik. Biasanya media disekitar koloni pada walnya berwarna coklat, kemudian berubah menjadi hitam (halo effect) dengan makin lamanya waktu inkubasi.
Apabila koloni yang khas (typical) tumbuh pada BSA setelah 24 jam ± 2 jam inkubasi, ambil 2 koloni atau lebih. Inkubasikan kembali media BSA selama 24 jam ± 2 jam. Setelah 48 jam ± 2 jam, ambil 2 atau lebih koloni yang khas (typical) yang tumbuh pada media BSA. Pengambilan ini dilakukan hanya bila koloni yang tumbuh pada media BSA yang diinkubasi selama 24 jam ± 2 jam memberkan reaksi yang tidak sesuai pada TSI dan LIA, yang menjadikan kultur ini dinyatakan sebagai bukan salmonella.
7.3.4.2. Pengamatan morphologi koloni salmonella yang tidak khas (typical).
Ciri – ciri koloni salmonella yang tidak khas adalah sebagai berikut :
a. HE dan XLD Agar.
Beberapa kultur salmonella membentuk koloni berwarna kuning dengan atau tanpa inti hitam. Jika tidak ada koloni khas yang tumbuh pada media HE dan XDL setelah inkubasi 24 jam ± 2 jam, ambil 2 atau lebih koloni yang tidak khas.
b. BSA
Koloni yang khas membentuk koloni berwarna hijau dengan sedikit atau tanpa warna kehitaman disekitar media. Jika tidak ada koloni yang khas atau koloni terduga pada media BSA setelah inkubasi 24 jam ± 2 jam, jangan mengambil koloni, tetapi inkubasi kembali media selama 24 jam ± 2 jam. Jika tidak ada koloni yang khas atau koloni tersangka pada media BSA setelah inkubasi 48 jam ± 2 jam, ambil 2 atau lebih koloni yang khas.
7.3.5. Amati secara hati – hati bagian tengah koloni dengan menggunakan jarum inokulasi steril dan goreskan kepermukaaan media TSI agar dengan cara menggores agar miring dan menusuk agar tegak. Tanpa mengambil koloni baru, gunakan jarum yang sama untuk menggores media LIA dengan menusuk agar tegak terlebih dahulu, setelah itu goreskan pada agar miring. Karena reaksi Lysine Decarboxylase sangan anaerobik. LIA miting harus mempunyai tusukan yang dalam (4 cm). Simpan media agar selektif yang telah diambil koloninya pada suhu 50C – 80C.
7.3.6. Inkubasi TSI dan LIA selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C dengan memberikan tutup sedikit kendur untuk mencegah terbentuknya H2S yang berlebihan. Pada TSI, kultur salmonella yang khas memberikan rekasi alkalin (merah) pada goresan agar dan asam (kuning) pada tusukan agar tegak, dengan atau tanpa H2S (warna kehitaman pada agar). Pada LIA, kultur salmonella yang khas memberi reaksi alkaline (ungu) pada keseluruhan tabung. Reaksi yang benar – benar kuning pada tusukan dinyatakan sebagai kutur negatif. Jangan hanya melihat diskrorasi pada tusukan untuk menyatakan kultur negatif. Umumnya kultur salmonella membentuk H2S pada LIA. Beberapa kultur non salmonella membentuk reaksi bata pada agar miring LIA. Reaksi TSI dan LIA dapat dilihat pada tabel dibawah ini.

Tabel 2. Reaksi biokimia salmonella pada TSI dan LIA

Media Agar Miring (goresan) Agar Tegak (tusukan) H2S
TSI Alkalin/K(merah) Asam/A(kuning) +/-
LIA Alkalin/K(ungu) Alkalin/K(ungu) +/- a
a umumnya kultur salmonella membentuk H2S pada media LIA

7.3.7. Semua kultur yang memberikan reaksi alkalin pada tusukan agar tegak LIA, tanpa memperhatikan reaksi TSI, harus dipertimbangkan sebagai potensial salmonella dan harus dilakukan uji biokimia dan serologi. Kultur yang memberikan reaksi asam pada tusukan agar tegak LIA dan alkalin pada agar miring serta asam pada tusukan agar tegak TSI harus juga dipertimbangkan sebagai potensial salmonella dan harus dilakukan uji bio kimia dan serologi. Kultur yang memberikan reaksi asam pada tusukan agar tegak LIA dan asam baik pada goresan agar miring dan tusukan agar tegak pada TSI, dapat dinyatakan sebagai bukan salmonella. Lakukan pengujian biokimia dan serologi terhadap kultur presunmtif-positif TSI sesuai 7.3.8. untuk menentukan adanya salmonella arizona.
Bila kultur TSI tidak memberikan reaksi typical salmonella (alkalin pada goresan agar miring dan asam pada tusukan agar tegak), ambil koloni terduga tambahkan lainnya dari cawan media selektif dan goreskan kepermukaan media TSI dan LIA sesuai 7.3.5.
7.3.8. Lakukan Uji Biokimia dan Serelogi terhadap ;
a) Tiga kultur presumtif-positif TSI dari 1 set media selektif (HE, HLD dan BSA) yang digoreskan dari SCB (atau RV Broth untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi) jika ada dan tiga kultur presumtif-positif TSI dari media selektif yang digoreskan dari TTB jika ada.
b) JIka tiga kultur presumtif-positif TSI tidak terisolasi dari 1 set media selektif, uji kultur presumtife-positif TSI yang lain. Uji sedikitnya 6 kultur TSI untuk setiap contoh yang dianalisa.
7.4. Identifikasi Salmonella
7.4.1. Kultur Campuran.
Apabila kultur pada TSI agar terlihat tercampur, maka goreskan kembali kedalam media HE atau XLD agar. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C. Amati koloni yang diduga salmonella.
a) HE agar
Koloni hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti hitam. Pada umumnya kultur salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
b) XLD agar
Koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Pada umumnya kultur salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau seluruh koloni telihat bewarna hitam. Pindahkan sedikitnya 2 koloni terduga salmonella pada media TSI dan LIA seperti pada butir 7.3.
7.4.2. Kultur Murni
a) Uji urease (konvesional)
Pindahkan 1 ose penuh dari masing – masing presumtif positif TSI Agar miring kedalam Urea Broth. Inkubasikan selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C.
c) Uji urease (cepat)
Pindahkan 1 ose dari masing – masing presumtif positif TSI Agar miring kedalam Rapid Urea Broth . Inkubasikan selama 2 jam dalam water bath pada suhu 370C± 0,50C. Reaksi salmonella yang khas untuk uji Urease memberikan hasil negatif ( tidak terjadi perubahan warna ).
7.4.3. Uji Serologi Polyvalent Flagellar ( H )
a. Uji ini dapat juga dilakukan setelah uji biokimia seperti yang diuraikan pada butir 7.4.4. Pindahkan 1 ose dari masing – masing TSI yang memberikan reaksi Urease negatif kedalam :
 5 ml BHI broth dan inkubasikan selama 4 jam – 6 jam pada suhu 350C ± 10C sampai terlihat pertumbuhan. Tambahkan 2,5 ml larutan formanilized Physiological Saline kedalam BHI Broth ( untuk diuji pada hari yang sama atau
 5 ml tryicase soy – Tryptose Broth (TSTB) dan inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C. Tambahkan 2,5 ml larutan formanilized Physiological Saline kedalam TSTB (untuk diuji pada hari berikutnya)
b. Siapkan 2 kultur dari TSI ( contoh dan kontrol ) yang telah diberi formanilized Physiological Saline dan uji dengan salmonella antisera. Masukkan ± 0,5 ml larutan salmonella Polyvalent Flagellar (H) antisera dalam tabung serologi 10 x 75 mm atau 13 x 100 mm. Tambahkan 0,5 ml antiagen yang akan diuji.Siapkan kontrol saline dengan mencampur 0,5 ml formanilized Physiological Saline dengan 0,5 ml formanilized antiagen. Inkubasikan campuran tersebut dalam waterbath pada suhu 480C – 500C. Amati setiap interval waktu 15 menit dan amati hasilnya selama 1 jam.
– Positif apabila terjadi penggumpalan dalam uji campuran dan tidak ada penggumpalan dalam kontrol.
– Negatif apabila tidak ada penggumpalan dalam uji campuran dan tidak ada penggumpalan dalam kontrol.
c. Perlakuan terhadap kultur yang memberikan hasil uji serologi flagellar (H) negatif.
Bila reaksi biokimia dari kultur serologi flagellar (H) negatif menunjukkan bahwa kultur tersebut adalah salmonella, penggumpalan flagellar (H) negatif mungkin disebabkan karena organisme nonmotil atau karena kurang cukupnya perkembangan antigen flagellar. Perlakuan kultur sebagai berikut : inokulasi Motility Test Medium dalam petri dish dengan menggunakan koloni yang tumbuh pada TSI miting. Inokulasi dengan cara menusuk media sekali 10 mm dari bagian tepi cawan sedalam 2 mm – 3 mm. Jangan menusuk sampai dasar cawan atau menginokulasi bagian yang lain. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 350C ± 10C. Bila organisme berpindah sejauh 40 mm atau lebih lakukan uji ulang sebagai berikut :
– Inokulasi dengan menggunakan jarum inokulasi sejumlah pertumbuhan terjauh ke dalam Trypticase Soy-Trytose Broth.
– Ulangi pengujian Polyvalent Flagellar (H), bila tidak terjadi pergerakan setelah 24 jam pertama, inkubasi kembali selama, bila masih tidak bergerak inkubasi sampai 5 hari pada suhu 25 0C.
– Nyatakan kultur sebagai tidak begerak (nonmotile) bila semua uji di atas masih tetap negatif, bila kultur memberikan reaksi flagellar (H) negatif tetapi memberikan reaksi biokiia positif, kirim kultur untuk diuji serotyping.
7.4.4. Pengujian kultur Urease negatif.
a) LDB
Uji ini dilakukan hanya jika reaksi LIA meragukan. Pindahkan 1 ose dari TSI kedalam media LDB. Kendurkan tutupnya dan inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C, tetapi amati setelah 24 jam. Salmonella memberikan reaksi alkalin ditandai dengan warna ungu pada seluruh media. Reaksi negatif ditunjukkan dengan warna kuning pada seluruh media. Jika hasil reaksi tidak menujukkan warna kuning atau ungu, tambahkan beberapa tetes 0,2 % bromocresol purple dyne dan amati perubahan warnanya.
b) Phenol red dulcitol atau Broth base dengan 0,5 % dulcitol.
Pindahkan 1 ose dari TSI ke dalam media dulcitol Broth. Kendurkan tutupnya dan inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C, tetapi amati setelah 24 jam. Pada umumnya salmonella memberikan hasil positif, ditandai dengan pembentukan gas dalam tabung durham dan pH asam (kuning) pada media. Reaksi negatif ditandai deangan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (Phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromocresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.
c) TB.
Pindahkan 1 ose dari TSI ke dalam media Tryptone Broth. Inkubasi 35 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C dan selanjutnya ikuti prosedur dibawah ini :
 Potasium Cyanida (KCN) Broth
Pindahkan 1 ose dari TB 24 jam ke dalam media KCN Broth. Tutup tabung rapat – rapat dan lapisi dengan kertas para film. Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C tetap amati setealah 24 jam. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan (ditandai dengan adanya kekeruhan). Umumnya Salmonella tidak tumbuh pada media ini yang ditandai dengan tidak terjadinya kekeruhan.
 Malonate Broth
Pindahkan 1 ose dari TB 24 jam kedalam media Malonate Broth. Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C, tetap amati setelah 24 jam. Kadang – kadang tabung Malonate Broth yang tidak diinokulasi berubah menjadi biru. Oleh karena itu gunakan Malonate Broth sebagai kontrol. Reaksi positif ditandai dengan perubahan warna yang menjadi biru. Umumnya salmonella memberikan reaksi negatif ( hijau atau tidak ada perubahan) pada Broth ini.
 Uji Indol
Pindahkan 5 ml TB 24 jam kedalam tabung kosong dan tambahkan 0,2 ml – 0,3 ml Reagent kovacs. Amati segera setelah penambahan Reagen. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya cincin merah pada permukaan media. Umumnya salmonella memberikan reaksi yang wanarnya berada antara orange dan pink dinyatakan sebagai ±.

Tabel 3. Reaksi biokimia dan serologi untuk salmonella

No Pengujian Hasil Reaksi Salmonella
positif negatif Reaksi Spesies a
1 Glucose (TSI) tusukan kuning tusukan merah +
2 Lysine Decarboxylase (LIA) tusukan ungu tusukan kuning +
3 H2S (TSI dan LIA) hitam tidak hitam +
4 Urease warna ungu sampai merah tidak ada perubahan warna
5 Lysine Decarboxylase Broth (LDB) warna ungu warna kuning +
6 Phenol Red Dulcitol Broth warna kuning dan atau ada gas tidak terjadi perubahan warna dan tidak ada pembentukan gas +b
7 KCN Broth pertumbuhan tidak ada pertumbuhan -c
8 Malonate Broth warna biru tidak ada perubahan warna
9 Uji Indol warna violet pada permukaan warna kuning pada permukaan
10 Uji Serologi Polyvalent Flagellar (H) penggumpalan tidak ada penggumpalan +
11 Uji Serologi Polyvalent Stomatic (O) penggumpalan tidak ada penggumpalan +
12 Phenol Red Lactose Broth warna kuning dan atau gas tidak terjadi perubahan warna dan tidak ada pembentukan gas -c
13 Phenol Red Sucrose Broth warna kuning dan atau gas tidak terjadi perubahan warna dan tidak ada pembentukan gas
14 Uji Voges Proskauer merah mudah sampai merah tidak ada perubahan warna
15 Uji Methyl Red warna merah menyebar warna kuning menyebar +
16 Simmons Citrate warna biru dan ada pertumbuhan tidak ada perubahan warna dan tidak ada pertumbuhan v

Dengan :
a +, 90 % atau lebih positif dalam 1 atau 2 hari
-, 90 % atau lebih positif dalam 1 atau 2 hari
v , variabel
b Mayoritas dari kultur salmonella arizone negatif
c Mayoritas dari kultur salmonella arizone positif

 Uji serologi Polyvalent Flagellar (H)
Jika uji serologi Polyvalent Flagellar (H) belum dilakukan, maka pengujian pada butir 7.4.3. dapat dilakukan pada tahap ini.
 Nyatakan kultur sebagai bukan salmonella bila reaksi indol dan flagellar (H) negatif, atau KCN positif dan LDB negatif.
7.4.5. Uji serologi Polyvalent Somatic (O)
Ambil 1 ose kultur dari TSI (dari butir 8.3f) yang telah diinkubasikan selama 24 jam – 48 jam dan letakkan diatas gelas preparat, kemudian tetesi dengan larutan saline 0,85 % steril dan emulsikan. Letakkan 1 tetes salmonella Polyvalent Somatic (O) antiserum disamping suspensi koloni. Campurkan koloni Antiserum sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai tercampur sempurna. Miringkan campuran tersebut ke kiri dan ke kanan, dan amati segera pada latar belakang yang gelap. Amati uji sebagai berikut :
Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada larutan kontrol.
Negatif apabila tidak terjadi penggumpalan baik pada larutan kultur maupun larutan kontrol.
7.4.6. Uji Bio Kimia Tambahan.
Nyatakan sebagai salmonella. Kultur yang memberikan reaksiyang khas seperti pada Tabel 3 butir 1 – 11. jika 1 kultur TSI dari setiap contoh yang diuji menunjukkan salmonella, uji biokimia tambahan tidak diperlukan. Kultur yang memberikan reaksi positif pada uji serologi flagellar (H) tapi tidak menunjukkan karakteristik salmonella pada uji biokimia, harus dimurnikan seperti pada butir 7.4.1 diatas dan uji kembali mulai pada butir 7.4.2. lakukn uji tambahan berikut ini terhadap kultur yang tidak memberikan reaksi yang khas seperti pada tabel 3.
a) Phenol red lactose atau purple lactose Broth
 Pindahkan 1 ose dari TSI agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam kedalam Phenol red lactose atau purple lactose Broth. Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C, tetap amati setelah 24 jam.
Positif apabila terjadi pembentukan asam (kuning) dan gas pada tabung durham. Apabila hanya terjadi pembentukan asam, maka dapat dinyatakan positif. Umumnya salmonella memberikan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (Phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.
 Nyatakan sebagai bukan salmonella jika kultur memberikan reaksi lactose positif, kecuali kultur yang memberikan reaksi asam pada tusukan agar tegak TSI dan reaksi alkalin pada tusukan agar tegak LIA, atau reaksi positif pada Malonate Broth.
b) Phenol red sucrose atau purple sucrose Broth.
 Pindahkan 1 ose dari TSI agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam kedalam Phenol red sucrose atau purple sucrose Broth. Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C, tetap amati setelah 24 jam.
Positif apabila terjadi pembentukan asam (kuning) dan gas pada tabung durham. Apabila hanya terjadi pembentukan asam, maka dapat dinyatakan positif. Umumnya salmonella memberikan hasil negatif, ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (Phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.
 Nyatakan sebagai bukan salmonella jika kultur memberikan reaksi sucrose positif, kecuali kultur yang memberikan reaksi asam pada tusukan agar tegak TSI dan reaksi alkalin pada LIA.
c) Methyl Red – veges – Proskauer (MR – VP) Broth
Pindahkan 1 ose dari TSI agar miring kedalam media MR-VP Broth dan inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C.
 Lakukan uji veges – Proskauer (VP) pada suhu ruang sebagai berikut :
Pindahkan 1 ml MR-VP Broth yang telah diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C kedalam tabung reaksi steril dan inkubasikan kembali MR-VP Broth selama48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C untuk pengujian Methyl Red. Tambvahkan 0,6 ml Alpha Alphanaphtol dan kocok. Tambahkan 0,2 ml larutan 40 % KOH dan kocok kembali. Untuk mempercepat reaksi tambahkan sedikit kristal kreatin, dan amati hasilnya setelah 4jam. Perubahan warna menjadi merah muda erosin sampai merah mirah delima (ruby) pada media menunjukkan reaksi positif. Umumnya salmonella memberikan reaksi VP negatif.
 Uji Methyl Red (MR)
Tambahkan 5 tetes – 6 tetes indicator Methyl Red kedalam media MR – VP yang telah diinkubasi selama 96 jam. Amati hasilnya dengan segera. Umunya salmonella memberikan reaksi positif, ditandai dengan terjadinya difusi warna. Nyatakan sebagai bukan salmonella kultur yang memberikan reksi KCN dan VP positif serta MR negatif.
d) Simmons citrat Agar
e) Pindahkan 1 ose dari TSI agar miring kedalam media Simmons citrat Agar miring dengan cara menggores agar miring dan menusuk agar tegak. Inkubasikan selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C.
Positif, apabila terjadi pertumbuhan yang biasanya diikuti dengan perubahan warna dari hijau menjadi biru. Umunya salmonella memberikan hasil citrat positif.
Negatif, apabila tidak ada atau sedikit sekali pertumbuhan dan tidak terjadi perubahan warna.

Tabel 4. Kreteria untuk pemishan kultur non salmonella

no Pengujian Hasil
1 Urease Positif (warna ungu sampai merah)
2 Uji Indol Positif (warna ungu sampai merah)
3 Polyvalent Flagellar (H) Negatif (tidak ada penggumpalan)
4 Lysine Decaboxylase Negatif (warna kuning)
5 KCN Broth Positif (ada pertumbuhan)
6 Phenol Red Lactose Broth Positif (warna kuning dan atau gas) a,b
7 Phenol Red Sucrose Broth Positif (warna kuning dan atau gas) b
8 Uji Voges – Proskauer Positif (warna merah muda sampai merah)
9 Uji Methyl Red Negatif (warna kuning menyebar)

7.4.7. Pelaporan
Apabila tidak ada 1 kultur TSI yang menunjukkan reaksi salmonella pada uji biokimia, lakukan uji biokimia mulai butir 7.4.4 terhadap kultur TSI lain yang memberikan reaksi Urease Negatif dari contoh yang sama.
Laporkan sebagai salmonella kultur – kultur yang mempunyai reaksi seperti pada tabel 3.
Laporkan sebagai bukan salmonella kultur – kultur yang memberikan reaksi seperti pada tabel 4.