1. Tujuan :
Memberikan petunjuk bagi analis dalam melakukan Pengujian Coliform dan Escherichia coli.

2. Ruang Lingkup :
Prosedur ini digunakan untuk melakukan Pengujian Coliform dan Escherichia coli pada produk perikanan dan produk makanan yang berkaitan dengan hasil – hasil perikanan.

3. Acuan :
Standar Nasional Indonesia (SNI) 01-2332.1-2006

4. Media dan Reagensia :
a. Brilliant Green Lactose Bile (BGLB), 2 % Broth
b. Lauryl Tryptose Broth (LTB)
c. EC Broth
d. Levine’s Eosin Methylen Blue (L-EMB) agar
e. Tryptone (Tryptophane) Broth (TB)
f. MR-VP Broth
g. Simmon Citrate Agar
h. Plate Count Agar
i. Larutan Butterfield’s phosphate buffered
j. Pereaksi Kovacs
k. Pereaksi VP
l. Indikator MR
m. Pereaksi pewarnaan gram
5. Peralatan :
a) Waterbath bertutup dengan sirkulasi 45 °C ± 0,5 °C
b) Inkubator 35 °C ± 1 °C .
c) Blender beserta jar yang dapat disterilisasi atau stomacher.
d) Botol pengencer.
e) Tabung durham.
f) Cawan petri 15 mm x 90 mm.
g) Tabung reaksi ukuran 16 mm x 150 mm dan 13 mm x 100 mm.
h) Timbangan dengan ketelitian 0,0001 gr.
i) Mikroskop.
j) Pipet atau pipetor : 1 ml, 5 ml dan 10 ml.

6. Kondisi Pengujian
Pengujian contoh kekerangan menggunakan 5 seri tabung pengenceran sedangkan untuk produk perikanan lainnya menggunakan 3 seri tabung pengencer.

7. Preparasi contoh
Dengan menerapkan teknik aseptis, contoh diambil secara acak dan dipotong kecil – kecil hingga berat masing – masing contoh yang akan diuji sesuai ketentuan pada tabel 1.
Contoh beku dilelehkan pada saat akan dianalisa dan pelelehan dilakukan selama 18 jam pada suhu sekitar 2 °C – 5 °C atau suhu dibawah 45°C dan tidak lebih dari 15 menit.

Tabel 1. Berat contoh yang diambil yang akan diuji

Berat Contoh Berat Contoh Yang Akan di Uji
kurang dari 1 kg atau 1 l 100 gr atau 100 ml
1 kg atau 1 l sampai dengan 4,5 kg atau 4,5 l 300 gr atau 300 ml
lebih dari 4,5 kg atau 4,5 l 500 gr atau 500 ml

8. Prosedur
8.1. Persiapan contoh
a) Untuk contoh dengan berat lebih kecil atau sama dengan 1 kg atau 1 l sampai dengan 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 25 g atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang akan diuji, kemudian masukkan dalam wadah atau plastic steril dan tambahkan 225 ml larutan Butterfield’s phosphate buffered.
b) Untuk contoh dengan berat lebih besar dari 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 50 g atau contoh cair sebanyak 50 ml, kemudian masukkan dalam wadah atau plastic steril dan tambahkan 450 ml larutan Butterfield’s phosphate buffered.
c) Homogenkan selama 2 menit (larutan pengenceran 10 -1)
8.2. Tahapan Analisa
8.2.1. Uji Pendugaan coliform (Presumptive coliform)
a) Siapkan pengenceran 102 dengan cara melarutkan 1 ml larutan 101 ke dalam 9 ml larutan Butterfield’s phosphate buffered . Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.
b) Pindahkan dengan menggunakan pipet steril sebanyak 1 ml larutan untuk setiap pengenceran kedalam 3 seri atau 5 seri tabung lauryl tryptose Broth ( LTB ) yang ber isi tabung durham.
c) Inkubasi tabung – tabung tersebut selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C. Perhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan inkubasikan kembali tabung – tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
d) lakukan Uji penegasan coliform untuk tabung –tabung positif
8.2.2. Uji penegasan coliform (comfirmed coliform)
a) Inokulasikan tabung – tabung LTB yang positif ke tabung BGLB Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose, inkubasi BGLB Broth yang telah diokulasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ±10C .
b) Periksa tabung – tabung BGLB yang menghasilkan gas selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ±10C. Tabung positif dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
c) Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabng- tabung BGLB yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai “APM/g coliform”
8.2.3. Uji pendugaan Escherichia coli (faecal coliform,presumptive Escherichia coli)
a) Inokulasikan dari setiap tabung LTB yang positif ketabung – tabung EC Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. Inkubasi EC Broth dalam waterbath sirkulasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 450C ±0,50C. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi.
b) Periksa tabung – tabung EC Broth yang menghasilkan gas selama 24 jam ± 2 jam, jika negatif inkubasikan kembali sampai 48 jam ± 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
c) Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung – tabung EC yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai “APM/g faecal coliform”.

8.2.4. Uji penegasan Escherichia coli (comfirmed Escherichia coli )
a) Dari tabung – tabung EC broth yang positif dengan menggunakan jarum ose gores ke LEMB agar. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35 0C ± 1 0C.
b) Koloni Escherichia coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik.
c) Ambil lebih dari satu koloni (typical) Escherichia coli dari masing – masing cawan LEMB dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan jarum tanam. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C.
d) Jika koloni yang khas (typical) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang tidak khas (typical) Escherichia coli ke media PCA miring.
8.2.5. Uji morfologi
Lakukan uji mikrobiologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherichia coli terduga. Biarkan diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama 24 jam Dengan menggunakan mikroskop, bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus.
8.2.6. Uji biokimia
8.2.6.1. Produksi indol ( I )
Inokulaikan 1 ose dari PCA miring kedalam tryptone Broth. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C. Uji indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 ml – 0,3 ml pereaksi kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning.
8.2.6.2. Uji Voges proskauer ( VP )
Inokulaikan 1 ose dari PCA miring kedalam MRVP Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C. Pindahkan sebanyak 1 ml dari setiap MRVP Broth yang tumbuh ke tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm seteril dan tambahkan 0,6 ml larutan alpha naphtol dan 0,2 ml 40 % KOH, kocok, tambahkan sedikit kristal kreatin untuk mempercepat reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam.Reaksi positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima ( ruby ).
8.2.6.3. Uji methyl red ( MR )
Inkubasi kembali MRVP Broth diatas (butir 8.2.6.2) selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C . Tambahkan 5 tetes indikator Methyl Red pada setiap MRVP Broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning.
8.2.6.4. Uji sitrat ( C )
Goreskan 1 ose dari PCA miring ( butir 8.2.4b) kepermukaan simmon citrat agar. Inkubasi selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.
8.2.6.5. Produksi gas dari laktosa
Inokulasikan 1 ose dari PCA miring kedalam LBT. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 350C ± 10C reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabung durham

9. Interprestasi Hasil
Tabel 2. Interprestasi Hasil

Kriteria Biotype 1 Biotype 2
Gas pada tabung LTB + +
Indol +
MR + +
VP
Citrate
Morfology Test Gram negatif, berbentuk batang pendek dan tidak berspora Gram negatif, berbentuk batang pendek dan tidak berspora

10. Pelaporan
Berdasarkan interpretasi hasil diatas (pasal 9), nyatakan coliform dan Escherichia coli dalam APM/g dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM).